邵晨
,
高友鹤
色谱
液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术是蛋白质组学研究中的常见方法.保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中.在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提高鉴定的可信度.鉴定的灵敏度也可以通过匹配多次LC-MS实验中具有相同精确质量数和保留时间的峰而提高.另一方面,由于色谱条件的微小改变即会引起保留时间的变化,因此对多次实验结果进行保留时间比对是进行非标记定量的不可或缺的步骤.另外,联合保留时间偏移和质量数信息还可以进行蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)的鉴定.
关键词:
液相色谱-串联质谱
,
保留时间预测
,
保留时间比对
,
多肽鉴定
,
非标记定量
,
翻译后修饰
,
蛋白质组学
许静静
,
刘幸
,
周虎
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2016.08047
蛋白质翻译后修饰(PTMs)是调节细胞内生理活动的重要途径.该文总结了近年来PTMs蛋白质组学相关的分离方法,包括反相(RP)色谱法、离子交换(IEX)色谱法、亲水相互作用色谱(HILIC)法、多孔石墨化碳(PGC)色谱法、毛细管电泳(CE)法及分子筛色谱(SEC)法等.这些新方法为磷酸化、乙酰化、糖基化等PTM肽段或蛋白质的鉴定提供了更高的分离度和灵敏度.此外,该文也介绍了蛋白质领域其他重要分离方法的研究进展,这些方法可能被进一步应用于PTMs蛋白质组学的研究中.
关键词:
翻译后修饰
,
蛋白质组学
,
反相色谱
,
离子交换色谱
,
亲水相互作用色谱
,
多孔石墨化碳色谱
,
毛细管电泳
李笃信
,
张凌怡
,
李彤
,
杜一平
,
张维冰
色谱
随着蛋白质组学、本草物质组学等组学概念的提出,所需分析的样品的成分越来越复杂,因此具有强大分离能力的多维液相色谱技术受到人们越来越多的关注.二维液相色谱中第二维的分离性能和速度是整个分离系统性能的关键.基于捕集柱模式,我们采用经特殊设计的流路系统,使得双捕集柱型接口具有预分离的功能.样品从第一维流出以后被富集在捕集柱1的柱头,经过脱盐后,正冲捕集柱,捕集柱1与第二维色谱柱联用对富集的样品进行分离,增加了第二维分离效率.当捕集柱上的样品全部被洗脱到第二维色谱柱上时,捕集柱2已经完成对第一维洗脱液中样品的捕集和脱盐,此时将阀进行切换,捕集柱2与第二维色谱柱直接相连进行洗脱.循环切换捕集柱1和捕集柱2,维持较高的阀切换频率,实现了第二维色谱柱的连续洗脱.因此保证了第二维分离具有较快速度,同时具有较高的分离效率.使用35 mm长捕集柱和十通阀为接口,以弱阴离子交换(WAX)色谱为第一维分离模式,以反相(RP)色谱为第二维分离模式,构建了WAX-RP二维液相色谱系统(2D-LC system).以小鼠血清为样品对系统进行了初步评价.色谱流出曲线出现了明显的界面现象,这是由于捕集柱流动相中含有的较多盐分流出时的背景吸收造成的.同时,由于界面两侧的流动相黏度不同产生了黏性指进(VF)现象.当第二维色谱柱长度为50 mm时,理论上可将第二维分离效能提高70% .该接口可以应用于多种二维液相色谱模式,适用于蛋白质组学和本草物质组学研究中对于复杂样品的分离分析.
关键词:
全二维液相色谱
,
改进型捕集柱接口
,
小鼠血清
,
蛋白质组学
谢沙洁
,
王方军
,
晏丹
,
周广东
,
叶明亮
,
邹汉法
色谱
将已建立的 7 cm 柱长的磷酸基团强阳离子交换富集整体柱与85 cm柱长的C12烷基反相整体柱结合的在线二维分离平台应用于软骨提取蛋白的蛋白质组分析.对20 μg软骨提取蛋白的酶解产物进行14个盐梯度的分级,然后对14个馏分进行反相色谱梯度分离及串联质谱鉴定,成功地鉴定得到了 7 434 个独立肽段对应的 1 901 个非冗余蛋白质.对所鉴定到的蛋白质进行定位分类,结果表明鉴定到的大部分蛋白质是来自于软骨细胞内部的低丰度蛋白质,这对于许多关节类疾病的研究有重要意义.
关键词:
整体柱
,
在线二维分离
,
蛋白质组学
,
软骨组织
洪广峰
,
高明霞
,
晏国全
,
关霞
,
陶芊
,
张祥民
色谱
为了构建高效的离子交换/反相二维液相色谱(IEC/RPLC)分离平台系统,提高复杂蛋白质样品的分离效率,对色谱柱进行了评价与筛选.通过对实际人肝蛋白质样品的分离效果的比较,选择确定了TSKgel DEAE-5PW弱阴离子交换色谱柱(WAX)作为第一维色谱分离柱;考察了同一规格的10支代表性反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,30 nm,C4、C8或C18),通过评价其对尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分离性能以及对3种标准蛋白质样品的非特异性吸附、对人肝蛋白质样品的WAX馏分的分离效果,最终确定以Jupiter 300 C4反相色谱柱作为第二维色谱分离柱.对两维色谱柱的选择优化为蛋白质高效分离二维液相色谱平台的搭建提供了可靠基础.
关键词:
蛋白质组学
,
多维液相色谱
,
蛋白质
,
Top-down技术
王继峰
,
赵新元
,
赵焱
,
马成
,
钟儒刚
,
钱小红
,
应万涛
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.04041
蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应.我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况.结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸＞肽段N端氨基酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞组氨酸＞天冬酰胺＞赖氨酸＞酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性.根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响.该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响.在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化.
关键词:
液相色谱
,
质谱
,
多反应监测
,
蛋白质组学
,
烷基化
,
碘乙酰胺
李楠楠
,
周廉淇
,
毛心丽
,
张姣
,
卫军营
,
林虹君
,
李佳斌
,
田芳
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.03057
建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides,QconCATs)结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法.首先对QconCAT重组蛋白质进行了纯度表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征结果表明重组蛋白质的纯度在99％以上,相对分子质量约为63.4 kDa.对QconCAT重组蛋白质酶切后的肽段混合物进行质谱分析,并经pFind和pLabel软件处理,验证了目标肽段.还考察了QconCAT重组蛋白质的酶切效率和18O标记效率,并对QconCAT蛋白质结合18O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价.实验结果表明,采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis,TTE)中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时,相对标准偏差小于20％,准确度较高,说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量.更重要的是所建方法不仅解决了细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术的重标试剂价格昂贵的问题,也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法.
关键词:
定量肽段串联体蛋白质
,
同位素稀释
,
多反应监测质谱
,
18O标记
,
蛋白质组学
曹晓林
,
巩佳第
,
陈铭学
,
于莎莎
,
卞英芳
,
曹赵云
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2014.06035
采用亲和去垢小柱净化，建立了水稻叶片蛋白质组的纳升液相色谱-串联质谱分析方法。水稻叶片蛋白质分别采用酚提取法结合十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）裂解，裂解液经亲和去垢小柱净化，酶解肽段用纳升液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱（nanoLC-LTQ / Orbitrap MS）分析，相关数据库检索鉴定。比较了超滤辅助样品制备法（FASP 法）、亲和去垢小柱法和丙酮沉淀法对 SDS 去除效率及对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明：3种方法均有较好的 SDS 去除效果（去除效率均大于95％）；尽管3种方法鉴定的蛋白质种类具有一定的互补性，但以亲和去垢小柱法鉴定的蛋白质数目最多，为563种，远多于 FASP 法和丙酮沉淀法的196和306种；此外，亲和去垢小柱法适合于各种相对分子质量和不同 pI 值蛋白质的净化，而 FASP 法和丙酮沉淀法中不同相对分子质量和 pI 值蛋白质均有类似程度的损失。采用本文建立的方法，一次进样分析可鉴定出水稻叶片蛋白质多达588种；肽段匹配数≥2的296个蛋白质的生物学功能主要分为结合活性、酶活性、转移运输活性和结构组成等。该蛋白质分析方法可为开展水稻蛋白质组学研究提供技术参考。
关键词:
亲和去垢小柱
,
纳升液相色谱-线性离子阱/ 静电场轨道阱组合式高分辨质谱
,
鸟枪法
,
蛋白质组学
,
水稻叶片
,
十二烷基硫酸钠
黄志
,
洪广峰
,
高明霞
,
张祥民
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.10020
构建了一种在线阵列式二维常规柱液相色谱系统，并将其应用于分离血浆中的完整蛋白质。该系统以1根强阴离子交换柱作为第一维分离柱，8根阵列式反相色谱柱作为第二维分离柱。强阴离子交换柱分离的馏分通过十通阀被依次转移到第二维预柱上并得到保留富集，随后第二维流动相通过分流器同时将预柱上的蛋白质反冲至分析柱上进行分离。二维之间以及第二维阵列色谱柱之间均相互独立，从而可以提高系统分离的通量和总峰容量。采用该系统对血浆中的蛋白质进行了完整蛋白质水平上的分离。该系统具有高通量和高分辨率的特点，为血浆样品中高丰度蛋白质的去除以及血浆样品的深入研究提供了一种有效的手段。
关键词:
阵列二维色谱
,
在线
,
蛋白质
,
血浆
,
蛋白质组学
