闵一
,
陈刚
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2009.05.025
依据液相色谱分离整体蛋白的效果与色谱柱柱长基本无关的事实,研究了动力学因素对疏水相互作用色谱(HIC)分离整体蛋白的影响.首次提出了用于线性梯度洗脱条件下蛋白分离的"条件板高"(H)概念,并将其用于动力学因素对分离整体蛋白的影响的表征.分别用常用的色谱柱和色谱饼对标准蛋白进行了分离,绘制了类似于van Deemter的"条件板高"对流动相线速(u)的曲线图.发现对应于色谱柱最低"条件板高"的适合线速约为色谱饼的1/5～1/15,且色谱饼的适合线速范围也较色谱柱宽得多.据此,用装填有HIC填料的色谱饼(10 mm×20 mm i.d.)在12 min内便可完全分离7种标准蛋白.还用装填有HIC填料的色谱饼对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化,在50 min内,仅用一步色谱法就可获得纯度≥97%的rhG-CSF,其质量回收率为39% ,比活＞1×108 IU/mg.可以预计,装填极细颗粒的刚性色谱填料的色谱饼可在高负荷条件下进行整体蛋白的高速和高分离度的分离、纯化并同时复性,达到"三高".
关键词:
疏水相互作用色谱
,
蛋白分离
,
分离度
,
色谱饼
,
动力学因素
,
生物工程
,
粒细胞集落刺激因子
李瑛
,
白泉
,
陈刚
,
王骊丽
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.03.013
建立了疏水型色谱饼(10 mm×20 mm i.d.)与反相色谱(RPLC)离线二维色谱快速分离制备人血清蛋白质组学样品,并用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测的方法.以4种标准蛋白质的稀溶液为模型进行分离富集,得到细胞色素c(Cyt-c)与肌红蛋白(Myo)的检出限均为1 pmol/μL,溶菌酶(Lys)和胰岛素(Ins)的检出限为0.1 pmol/μL.将此方法用于人血清蛋白质组学样品的分离与制备,随着血清处理量的增大,质谱可检出的组分数目与信号强度均增加,当血清处理量达到 1.0 mL 时,可检出低丰度蛋白质或多肽285个(相对分子质量均在15 000以下).研究中将1 μg Cyt-c加入到0.5 mL血清中,用上述方法在分离富集低丰度Cyt-c上取得了很好的效果.结果表明,采用疏水型色谱饼与反相色谱联用技术不仅可对血清样品中低丰度蛋白质进行有效的分离和富集,而且一次样品的处理量大,可显著提高低丰度蛋白质的分析、检测水平.
关键词:
二维液相色谱
,
基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱
,
色谱饼
,
蛋白质组学
,
人血清
