马岩
,
张万军
,
卫军营
,
牛明
,
林虹君
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00205
复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提."鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一.本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析.将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905.该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景.
关键词:
反相高效液相色谱
,
pH梯度洗脱
,
有机溶剂梯度洗脱
,
纳升级反相高效液相色谱-串联质谱
,
肽混合物
,
酵母
毛心丽
,
卫军营
,
牛明
,
周廉淇
,
王雪颖
,
佟巍
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.11020
建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较.结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系(如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62％和92.41％,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定.该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用.
关键词:
液相色谱
,
保留时间
,
智能化选择反应监测
,
质谱
,
目标蛋白质组学
,
腾冲嗜热菌
白海红
,
范超
,
沈丙权
,
田芳
,
邓玉林
,
潘一廷
,
秦伟捷
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2014.11022
蛋白质的 N-糖基化修饰与多种重要的生理、病理进程密切相关，是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。由于糖蛋白本身多是低丰度表达的蛋白质，且糖链结构具有高度微不均一性，这使得蛋白质糖基化修饰的分析具有一定的挑战。本研究利用表面引发-原子转移自由基聚合（ SI-ATRP ）法，以带有双键的氨基葡萄糖为单体（GMAG），成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料（pGMAG-SiO2）。由于在硅胶表面引入致密的亲水聚合物层，该填料不仅保持了硅胶良好的机械强度，而且显著提高了其亲水性，因此非常适合作为亲水填料用于蛋白质的N-糖链富集。以麦芽七糖和鸡卵清蛋白的N-糖链为研究对象，考察了该填料对N-糖链的富集效果，并将该杂化填料成功用于人血浆中糖蛋白 N-糖链的富集检测，共鉴定了47种糖型。以上结果表明，pGMAG-SiO2填料对N-糖链具有较高的亲和性，可以用于 N-糖链的高覆盖率鉴定。
关键词:
表面引发-原子转移自由基聚合反应
,
核壳型硅胶填料
,
N-糖链
,
N-糖基化蛋白质
时照梅
,
范超
,
黄俊杰
,
白海红
,
秦伟捷
,
蔡耘
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2014.09037
生物体内蛋白质的糖基化修饰调控着细胞识别、细胞黏附和迁移以及免疫应答等多种生理过程,并与多种人类重大疾病的发生、发展密切相关.因此对蛋白质糖基化修饰的鉴定,不仅能够为生物学机理研究提供重要信息,对疾病诊断标志物和治疗靶标的发现也至关重要.然而在复杂生物体系中,大多数糖蛋白为低丰度蛋白质,其含量与现有质谱仪器的检测灵敏度之间存在较大差距,所以对含有不同糖型结构的糖蛋白进行全面/高效的富集,是实现高灵敏度糖蛋白鉴定的必由之路.凝集素富集作为一种有效的糖蛋白富集方法,已在糖蛋白质组学研究中得到了广泛的应用.针对现有凝集素功能化材料存在负载量偏低以及富集效率有限等问题,我们制备了两种以氧化石墨烯(GO)为载体的新型固定化凝集素,利用GO比表面积大,功能基团含量高,分散性、化学稳定性好等特点,实现了高负载量的凝集素固定(GO-ConA 2.073 mg/mg,RSD=1.0％;GO-WGA 1.908 mg/mg,RSD=0.14％).同时考察了材料的可重复使用性与稳定性:每隔3天测一次同一GO-lectin材料对对应糖蛋白的富集效果,可以看出材料合成两周内富集效果都＞200 μg/mg.将该GO-lectin成功应用于糖蛋白、糖肽的选择性富集,在糖蛋白质组学研究中体现出良好的应用潜力.
关键词:
凝集素
,
氧化石墨烯
,
富集
,
糖蛋白
,
糖肽
王雪颖
,
秦伟捷
,
钱小红
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2012.01035
建立了氨基酸同位素稀释液相色谱-串联质谱法准确测定合成肽段绝对含量的方法.实验中对合成肽段的纯度进行了表征,色谱纯度表征结果为99％以上,质谱纯度为90％以上.在肽段溶液中加入13C标记的氨基酸后进行酸溶液水解时间的优化,水解后的氨基酸直接经液相色谱分离和质谱检测,结果表明肽段中的被测氨基酸在150℃、6 mol/L HC1溶液水解4～6h就可以达到水解平衡.每个肽段选择两个或两个以上的被测氨基酸,测得随机选择的5种合成肽段的绝对含量为62.07％ ～ 88.18％,测定结果的相对标准偏差小于8％,相对误差小于5％,均满足定量要求.除常用的被测氨基酸苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸外,还考察了选择赖氨酸和精氨酸作为被测氨基酸的可行性,实验结果表明增加精氨酸为被测氨基酸是可行的,从而进一步增加了方法的普适性.该方法的建立避免了色谱法定量时氨基酸衍生化处理带来的副反应影响及操作繁琐等问题,提高了肽段含量测定的准确度和精密度,为肽段含量的准确测定提供了一种新的方法.
关键词:
液相色谱
,
同位素稀释质谱法
,
合成肽段
,
氨基酸分析
宋子凤
,
张庆林
,
张养军
,
秦伟捷
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2012.02006
利用原子转移自由基聚合法制备了鳞片状聚合物修饰的硅胶填料,将其作为一种新型的固定化酶载体,实现了蛋白酶的高密度固定,从而明显缩短了复杂蛋白质样品的酶解时间.使用标准蛋白质对固定化酶的酶解效率进行了考察,结果表明:鳞片状聚合物修饰的新型固定化酶硅胶填料具有较高的酶解效率,酶解标准蛋白质1 min 后,鉴定到肽段的氨基酸序列覆盖率可达95％以上.将该固定化酶硅胶填料成功应用于大肠杆菌全蛋白质的酶解,从2 min酶解肽段的混合物中鉴定到的蛋白质数量超过同样条件下溶液酶解12h的结果.另外,该固定化酶硅胶填料可以重复使用,其酶解效率具有良好的稳定性和重现性；该固定化酶具有较好的样品回收率,因而可以应用于蛋白质组学研究中.
关键词:
原子转移自由基聚合反应
,
鳞片状聚合物修饰硅胶
,
制备
,
胰蛋白酶固定
,
蛋白质组学
潘一廷
,
马成
,
白海红
,
张养军
,
秦伟捷
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.03055
为了增加开管毛细管柱(OTCC)的相比,提高分离效率,发展了表面引发原子转移自由基聚合法(SI-ATRP)制备葡萄糖聚合物修饰的开管毛细管柱.通过扫描电镜观察,该开管柱内壁上修饰了三维波浪状聚合物,明显增加了内壁比表面积和相比.在pH 3 ～11范围内,对含糖聚合物修饰的开管柱和空柱的电渗流进行了比较.修饰后开管柱的电渗流仅为空柱的1/2 ～ 1/3,且在pH6 ～11范围内保持平稳.稳定的电渗流保证了分离的重复性和稳定性.用该开管毛细管柱成功实现了小分子混合物(苯丙氨酸、胸腺嘧啶、腺苷、鸟苷、5-溴尿嘧啶、水杨酸)以及蛋白质大分子(核糖核酸酶B、转铁蛋白和牛血清白蛋白)的有效分离,结果表明葡萄糖聚合物修饰的开管毛细管柱具有良好的重复性和稳定性.
关键词:
表面原子转移自由基聚合
,
毛细管电色谱
,
开管毛细管柱
,
糖聚合物
范超
,
宋子凤
,
秦伟捷
,
蔡耘
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.01007
采用原子转移自由基聚合法制备了亲水聚合物修饰的硅胶颗粒作为一种新型固定化酶载体,在实现胰蛋白酶高密度固定的同时,显著降低了载体材料非特异性吸附导致的样品损失.因此,该固定化酶材料兼具高酶解效率和高回收率的特性.以标准蛋白质牛血清白蛋白(BSA)为样本,使用该固定化酶1 mm即可完成酶解,鉴定到肽段对BSA的氨基酸序列覆盖率可达90％以上.该固定化酶材料成功应用于酵母菌全蛋白质复杂样本的酶解,从3 min酶解产物中鉴定到666个蛋白质,超过同样条件下溶液酶解12 h的鉴定结果.
关键词:
固定化酶
,
蛋白质组学
,
原子转移自由基聚合反应
