曹诗林
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徐培
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马永正
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姚潇晓
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姚远
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宗敏华
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李雪辉
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娄文勇
催化学报
doi:10.1016/S1872-2067(16)62528-7
催化剂是化学工业的重要基础，其中酶是重要的高效天然催化剂。近年来，酶被越来越多地应用于工业领域，如精细化工、食品工业、制药工业、纺织业和制浆造纸。然而，由于游离酶存在价格昂贵及操作稳定性(特别是回收与重复使用性能)低等缺点，其在工业上的进一步应用受到一定限制。对酶进行固定化是解决上述问题的有效途径。一个理想的酶固定化技术需要载体具有良好的生物相容性和高比表面积，能够负载适量的酶并且具有很好的重复使用性能，固定化酶的过程简单温和，所得到的固定化酶制剂具有良好的催化性能、稳定性以及工业应用价值。尽管固定化酶技术经过了多年的发展，但仍需进一步研究。近几年，人们研究了基于纤维素纳米晶类、聚多巴胺类纳米载体以及生物相容性合成有机物纳米胶等新型载体对酶的固定化，取得了较好的成果。本文综述了这些新型纳米载体的制备以及酶的固定化过程，阐述了纳米载体固定化酶的结构和催化性能，并展望了发展前景。纤维素是全球产量最高、来源最广的生物聚合物。纤维素经过一定的酸(常用硫酸和盐酸)水解处理后，剩下的是具有高结晶度的纤维素纳米晶。它具有高比表面积、高机械强度和高长径比等优异性能。因此，研究者利用纤维素纳米晶作为载体进行酶固定化，获得了高负载量、高催化性能的固定化酶制剂。基于仿生矿化法制备的聚多巴胺类材料近年来获得研究者越来越多的关注。多巴胺具有良好的自聚合能力，可以对无机、有机等各种材料进行表面修饰。同时，聚多巴胺中含有的活性官能团可以与酶发生交联，从而达到固定化酶的效果。基于合成性聚合物纳米胶载体的固定化酶技术同样是一个新兴的、有意义的研究领域。相关的固定化过程可分为两大类：(1)在酶分子表面通过原位聚合生成纳米胶(growing-from过程)；(2)将酶与预先合成的纳米胶进行交联(grafting-to过程)。其中， growing-from过程是先将酶分子丙烯酰化，再进行原位聚合。而原位聚合又可分为自由基聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)和可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)。其中， ATRP和 RAFT主要用于制备环境响应型的酶-聚合物纳米凝胶。
关键词:
酶固定化
,
纤维素纳米晶
,
聚多巴胺
,
生物相容性材料
郭潇潇
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徐培
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宗敏华
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娄文勇
催化学报
doi:10.1016/S1872-2067(17)62787-6
甲壳素,又名几丁质(chitin),是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然多糖,有第六生命要素之美称.其主要存在于甲壳类动物的外壳、真菌细胞的细胞壁以及一些昆虫的外壳中,每年自然界中约有100多亿吨甲壳素生成.甲壳素是由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的二元线性聚合物,分子链中分布许多羟基、氨基及乙酰氨基,形成大量分子间及分子内氢键,致使其结晶度较高,化学性质十分稳定,直接利用较为困难.甲壳素不溶于稀酸、稀碱以及一般有机溶剂,工业上常用强酸强碱法处理甲壳素,以制备壳寡糖类产品,但该方法具有产品结构不单一,环境污染较为严重等缺点.甲壳素酶可特异性水解甲壳素链中β-1,4糖苷键,得到甲壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖.酶解法降解甲壳素工艺简单、反应条件温和、环境友好,有很好的应用前景.我们以Paenibacillus pasadenensis CS0611为出发菌株,以蟹壳粉末为培养基唯一碳源及氮源,在适宜条件下培养48 h.发酵液经离心、硫酸铵(80％饱和度)盐析、透析除盐后得到粗酶液.再利用HiTrap DEAE FF离子交换层析和HiLoad 26/600Superdex 200 pg凝胶过滤层析对该粗酶液进行分离纯化,以得到电泳纯甲壳素酶.所制备甲壳素酶比活力为10.28 U/mg,最终纯化倍数为5.3,酶活得率为15.7％.SDS-PAGE结果表明,该甲壳素酶相对分子质量约为69 kDa.后经MALDI-TOF-MS鉴定,该酶部分肽段和来源于另一株Paenibacillus pasadenenss的甲壳素酶(accession No:gi655151624)具有较高的同源性,进一步证实所纯化蛋白为甲壳素酶.对上述纯化的甲壳素酶的酶学性质进行研究,结果发现:其最适反应温度为50℃,在20-35℃内有较好的稳定性,50℃及以上热稳定性较差;最适pH为5.0,在pH4.0-11.0间具有较高稳定性,表明该酶具有很好的耐碱性;金属离子对该酶催化活性没有明显的激活作用,表明该甲壳素酶是非金属酶.同时,对该酶的底物特异性进行研究,发现该酶对胶体甲壳素和甲壳素水解能力较强,对淀粉和纤维素无水解能力,对不同脱乙酰度的壳聚糖的水解程度随脱乙酰度不同而变化,表明该酶只能特异性识别并降解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键;以胶体甲壳素为底物时,米氏常数Km为4.41 mg/mL,最大反应初速度为1.08 mg/min.利用薄板层析和高效液相色谱对酶解产物进行分析,结果表明该甲壳素酶对胶体甲壳素的降解产物主要是(GlcNAc)2.综上所述,本研究所涉甲壳素酶在甲壳二糖的酶法制备方面具有较好的应用前景.
关键词:
甲壳素酶
,
分离纯化
,
酶学性质
,
类芽孢杆菌属
