迟明
,
毕炜
,
卢庄
,
宋丽娜
,
贾伟
,
张养军
,
钱小红
,
蔡耘
色谱
二氧化钛富集法作为目前使用最为广泛的金属氧化物富集磷酸肽的方法,在富集过程中常常对富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性非磷酸化肽段存在一定的非特异性吸附作用.这些肽段与磷酸化肽段一同被富集,降低了磷酸肽富集的选择性.传统方法中使用的非特异性吸附抑制剂常会对质谱的电喷雾离子源造成污染,因而限制了其在液相色谱-质谱联用(LC-MS)系统中的应用.本研究将天冬氨酸作为一种新型的非特异性吸附抑制剂加入到二氧化钛富集体系中,并分别对3种和9种标准蛋白质酶切肽段混合物进行富集实验,同时与添加另一种非特异性吸附抑制剂--谷氨酸以及不添加任何非特异性吸附抑制剂的富集体系进行了富集效果的比较.结果表明,天冬氨酸可以有效地提高二氧化钛对磷酸肽富集的选择性.将添加天冬氨酸的二氧化钛富集体系应用于鼠肝全蛋白质磷酸肽的富集中,同样取得了很好的效果,表明天冬氨酸在复杂的生物样本的磷酸肽富集中也同样具有良好的应用前景.此外,由于天冬氨酸在反相色谱中极易被洗脱去除,从而避免了传统抑制剂对LC-MS系统离子源的污染问题.
关键词:
二氧化钛
,
富集
,
非特异性吸附抑制剂
,
天冬氨酸
,
磷酸肽
,
鼠肝
马岩
,
张万军
,
卫军营
,
牛明
,
林虹君
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00205
复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提."鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一.本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析.将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905.该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景.
关键词:
反相高效液相色谱
,
pH梯度洗脱
,
有机溶剂梯度洗脱
,
纳升级反相高效液相色谱-串联质谱
,
肽混合物
,
酵母
毛心丽
,
卫军营
,
牛明
,
周廉淇
,
王雪颖
,
佟巍
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.11020
建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较.结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系(如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62％和92.41％,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定.该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用.
关键词:
液相色谱
,
保留时间
,
智能化选择反应监测
,
质谱
,
目标蛋白质组学
,
腾冲嗜热菌
李楠楠
,
周廉淇
,
毛心丽
,
张姣
,
卫军营
,
林虹君
,
李佳斌
,
田芳
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.03057
建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides,QconCATs)结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法.首先对QconCAT重组蛋白质进行了纯度表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征结果表明重组蛋白质的纯度在99％以上,相对分子质量约为63.4 kDa.对QconCAT重组蛋白质酶切后的肽段混合物进行质谱分析,并经pFind和pLabel软件处理,验证了目标肽段.还考察了QconCAT重组蛋白质的酶切效率和18O标记效率,并对QconCAT蛋白质结合18O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价.实验结果表明,采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis,TTE)中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时,相对标准偏差小于20％,准确度较高,说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量.更重要的是所建方法不仅解决了细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术的重标试剂价格昂贵的问题,也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法.
关键词:
定量肽段串联体蛋白质
,
同位素稀释
,
多反应监测质谱
,
18O标记
,
蛋白质组学
金祖耀
,
吕雅瑶
,
周珊珊
,
郝斐然
,
付斌
,
应万涛
,
钱小红
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2015.01036
为了实现蛋白质组的深度覆盖，特别是低丰度蛋白质的定性鉴定和定量分析，目前常用的方法是采用更长或装填更小粒径填料的毛细管色谱柱，但因此带来的问题是色谱柱反向柱压显著升高。针对以上问题发展了一种简单的毛细管色谱柱电加热装置制作方法，并将该装置安装于液相色谱-质谱联用系统，分别以牛血清白蛋白（ BSA）酶切肽段混合物和酵母蛋白（ yeast）酶切肽段混合物为样品，从柱压和柱效两方面对该装置的性能进行了评价。实验结果表明，所制作的毛细管柱电加热装置安装在装填粒径为3μm 反相色谱填料的毛细管柱上，在最佳电流（100 mA）下对 BSA及 yeast酶切肽段混合物进行分离时的柱压比不加电流时的柱压降低至少50％，柱效略有升高。这说明所制作的毛细管色谱柱电加热装置能显著降低柱压，为在较低的柱压条件下选择更小粒径色谱颗粒填料的毛细管色谱柱提供了一种有效的方法。
关键词:
毛细管高效液相色谱-串联质谱
,
蛋白质组学
,
电加热装置
,
柱压
,
柱效
隋少卉
,
王京兰
,
卢庄
,
蔡耘
,
张养军
,
蔚文峰
,
钱小红
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.02.012
为了在短时间内获得相对含量高的磷酸化肽段,以标准磷酸化蛋白质为模型对强阳离子交换色谱(SCX)分离磷酸化肽段体系的缓冲溶液和梯度设置进行了研究,并用酵母酶切肽段混合物考察了该路线在较复杂的样品中的应用.实验结果表明优化后的体系能够在30 min内分离出磷酸肽段,而且非磷酸化肽段的干扰很少,这样便相对提高了磷酸化肽段在质谱仪中的响应强度,重要的是该体系可以对复杂样品进行很好的分离.这说明SCX用于规模化磷酸化肽段富集的策略是可行的.本研究为磷酸化蛋白质组学规模化分析提供了实用技术.
关键词:
磷酸化
,
位点
,
强阳离子交换色谱
,
富集
,
蛋白质组学
李佳斌
,
周廉淇
,
颜辉
,
李楠楠
,
郝斐然
,
田芳
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.11042
建立了金属标记结合高效液相色谱-选择性离子监测质谱（SIM）的蛋白质绝对定量新方法。实验考察了金属标记效率、金属标记的稳定性、标记后肽段的色谱保留和质谱行为、新定量方法的线性范围和准确度。实验结果表明金属标记具有标记效率高，稳定性好，色谱保留行为一致等优点。另外，金属标记-选择离子监测质谱绝对定量方法灵敏度高，其定量限低至1 fmol，线性范围为1~500 fmol，线性范围内 R2值大于0.99，具有良好的线性关系；经过测量，标准肽段的回收率为117.01％，说明该方法具有较高的准确度。将该方法应用于腾冲嗜热菌中烯醇酶蛋白的定量分析，相对标准偏差为5.47％，表明该方法的精密度高。以上结果表明该方法可以用于生物样本中的蛋白质的绝对定量分析，为比较简单的生物样本中蛋白质的绝对定量方法提供了一种新的选择。
关键词:
金属标记
,
高效液相色谱
,
选择离子监测质谱
,
蛋白质
,
绝对定量
周珊珊
,
翟睿
,
焦丰龙
,
郝斐然
,
吕雅瑶
,
钱小红
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2015.11033
近年来随着生命科学等领域的深入发展，人们对微量样本分离分析的需求越来越高，液相色谱系统的微量化受到了更多的关注。由于开管毛细管色谱柱具有较低的反向压力，可通过采用更长的色谱柱提高柱效，从而实现对复杂生物样本的高效分离，因而成为液相色谱柱新的发展方向。本文对开管毛细管色谱柱的制备方法及应用进展进行了综述。
关键词:
毛细管液相色谱
,
开管毛细管色谱柱
,
多孔层
,
蛋白质组学
,
综述
张养军
,
申烨华
,
张启东
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2000.06.003
提出了以醋酸-水作为流动相的体系中,在ODS柱上分离生物大分子的反相高效液相色谱(RPLC)方法.实验结果表明,醋酸-水的洗脱能力强于甲醇-水-三氟醋酸体系,在一定程度上克服了色谱分离中一些蛋白质的不可逆吸附且具有便于冷冻干燥的优点.用参数Z(1mol溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时从两者接触表面释放出置换剂的摩尔总数,logI(与1mol溶质对固定相亲和势有关的常数)和j(与1mol溶剂对固定相亲和势有关的常数)对9种蛋白质在此流动相体系中的保留进行了表征.该流动相使在RPLC中用于分离生物大分子的三元流动相体系成为二元流动相体系,更适合于理论研究.同时得出结论:在醋酸-水体系中,蛋白质与固定相之间的作用力主要为非选择性作用力;蛋白质在醋酸-水和甲醇-水-三氟醋酸两种流动相体系中的分子构象变化不同.
关键词:
反相高效液相色谱法
,
计量置换
,
生物大分子
郭鸿
,
张养军
,
高娟
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2001.01.001
比较了Snyder经验公式中的K0w与S和溶质计量置换保留模型（SDM-R）中溶质保留参数Z（1mol溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时，在其接触表面处释放出溶剂或置换剂的总摩尔数）与lgI（与1mol溶质对固定相的亲和势有关的常数）之间的定量关系。SDM-R中的两个参数间不仅对同系物溶质可以有很好的线性关系，而且对非同系物溶质也有很好的线性关系。其线性关系的好坏主要取决于这两个参数数值范围的大小，与文献中报告的线性关系取决于是否单因素影响溶质的保留和完全由统计学规律决定的结论不同。与Snyder经验公式中相对应的参数进行了比较，SDM-R保留参数的线性范围比Snyder公式中参数的线性范围宽。
关键词:
反相高效液相色谱
,
溶质保留参数
,
溶质计量置换保留模型
,
同系物
,
非同系物
