按照人金属硫蛋白-3(hMT-3)的基因序列,选用大肠杆菌偏爱的密码子合成了全长hMT-3基因,并将其插入大肠杆菌融合表达质粒pALEX的多克隆位点中,在谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)下游与GST融合表达.通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)LysS中表达了与重金属离子镉结合的融合蛋白GST-Cd2+-hMT-3.经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明融合蛋白主要在超声上清液中.分别通过"先纯化、后酶切"和"亲和柱色谱原位酶切"两种方法纯化了Cd2+-hMT-3,比较了两种方法的纯化效率和得率,表明原位酶切法操作简便,较之"先纯化、后酶切"法减少了洗脱、透析、冻干等步骤,从而也减少了样品的损失,提高了样品的纯度和得率.从摇瓶培养菌液中纯化获得了结合有Cd2+的完整的人金属硫蛋白-3,得率为1.8% .氨基酸组成分析结果表明所获得的Cd2+-hMT-3不含芳香族氨基酸和组氨酸,符合金属硫蛋白的特征;直读电感耦合等离子体发射光谱分析其硫镉原子比为21∶(7.5±0.1),与理论值21∶7基本吻合.
参考文献
| [1] | Uchida Y,Takio K,Titani K,Ihara Y,Tomonaga M.Neuron,1991,7(2):337 |
| [2] | Palmiter R D,Findley S D,Whitmore T E,Durnam D M.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(14):6 333 |
| [3] | Ji Liangnian,Mo Tinghuan.Bioinorganic Chemistry-An Introduction.Guangzhou:Zhongshan University Press (计亮年,莫庭焕.生物无机化学导论.广州:中山大学出版社),1992:311 |
| [4] | Vallee B L.Methods in Enzymology,1991,205:3 |
| [5] | Wang S H,Chang C Y,Chen C F,Tam M F,Shih Y H,Lin L Y.Gene,1997,203:189 |
| [6] | Bogumil R,Faller P,Pountney D L,Vasak M.Eur J Biochem,1996,238(3):698 |
| [7] | Shi Y,Du L,Zheng W,Tang W.Biometals,2002,15:421 |
| [8] | Zheng W,Wu F,Zhuang H,Lu C,Yang F,Ma W,Hua Z.Preparative Biochemistry and Biotechnology,2004,34:265 |
| [9] | Luo Z,Hua Z.Biochemistry and Molecular Biology International,1998,46(3):471 |
| [10] | Smith D B,Johnson K S.Gene,1988,67:31 |
| [11] | Chen Cheng,Zhuang Hongqin,Zheng Weijuan,Hua Zichun.Chinese Journal of Chromatography (陈成,庄红芹,郑伟娟,华子春.色谱),2004,22(4):456 |
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